回到天京后，李秀成向洪秀全提出了放弃京城、另寻他处的战略建议，指出目前天京已被重重包围，内部粮草不足，外部救援无望。然而，洪秀全坚决反对撤离，并威胁要革去李秀成的官职。洪秀全自信地宣称自己的江山如铁桶般坚固，即使没有李秀成的支持也能得到其他人的扶持。对此，李秀成感到非常愤怒，甚至表示宁愿被立即处决也不愿日后受刑。事后，洪秀全意识到自己的态度过于强硬，于是派人安抚李秀成，并继续让他负责天京的防守工作。
从那时起直到天京最终失陷，李秀成一直坚守在天京。他曾下令李世贤领军前往江西筹集粮食，计划在秋收后返回援救天京。
十一、忠贞殉国
1864年正月，太平天国的天保城失陷，天京被湘军彻底包围。此时，李秀成负责全城的防守工作。四月十九日，洪秀全病逝，为了稳定军心，李秀成在五日后扶立洪秀全长子洪天贵福（即幼天王）继位。然而，此时天京城内的军队只剩下了一万多名，其中能够作战的士兵仅有三四千人，而且粮草已经断绝。湘军对天京的围攻日益紧迫，他们从东门到北门沿城墙挖掘地道以图攻城。尽管如此，李秀成还是指挥守城部队连续破坏了几十处地道。
到了五月，地保城也落入敌手，湘军利用猛烈的炮火掩护，逼近太平门，并继续挖掘地道进行攻击。六月间，湘军终于通过炸塌城墙的方式冲入城内。面对突如其来的进攻，太平军一万多人与敌人展开了殊死搏斗，一部分战士战死沙场，其余则试图在混乱中突围。李秀成见势不妙，立即奔回朝门，将自己的战马让给了幼天王洪天贵福骑乘，并率领残部保护其逃往清凉山暂避。经过一番周折，洪天贵福得以逃脱追捕。而李秀成本人则换乘了一匹体力不佳的马，在初更时分假扮成清兵，试图从太平门缺口冲出。不幸的是，由于坐骑无法快速行进，他很快便与大队人马走散，流落到了方山一带。当地百姓曾试图帮助他脱险，但最终还是被八村村董陶大来发现并捉获，随后被交给了湘军将领萧孚泗。
李秀成被捕后，被送往曾国荃的军营。曾国荃因为自己的兄弟曾国华曾在三河镇战役中丧生于李秀成之手，因此对其怀有深仇大恨。他在审讯过程中摆列了刀、锥等刑具，意图将李秀成残忍地处决。据记载，曾国荃不仅命令手下用锥子刺伤李秀成的手臂和大腿，甚至亲自上阵施以酷刑，导致后者血流如注。即便如此，李秀成依然表现得异常坚强，他对曾国荃痛斥道：“曾九！各扶其主，你生什么气？且兴灭无常，今天偶然得逞，就发疯了吗？”这种坚毅的态度赢得了旁观者的敬佩。
在狱中，李秀成以惊人的毅力每天写下7000多字的自述，详细记录了自己的一生经历以及对太平天国运动的看法。这份《李秀成自述》长达数万字，但由于种种原因，原稿卷末第74页以后的内容部分被撕去，未能完整保存下来。据说，李鸿章在读完这部自述后也为之动容，称赞李秀成是“英雄人物”。然而，根据历史学家罗尔纲的研究，曾国藩可能出于邀功的目的而夸大或扭曲了一些史实，并担心清廷会对李秀成进行审讯，从而揭露不利于己方的信息，因此未经请示便擅自决定将其杀害。此外，还有一种说法认为，李秀成曾经试图效仿三国时期的姜维诈降，并劝说曾国藩称帝反清，但这只是后来流传的一种猜测，并没有确凿证据支持。
1864年8月7日，也就是太平天国甲子十四年六月二十五日，曾国藩派候补知府李鸿裔告知仍在撰写“天朝十误”等内容的李秀成，当天他将被处决。面对即将到来的死亡，李秀成表现得非常从容，他对李鸿裔表示：“中堂厚德，铭刻不忘；今世已误，来生愿图报。”傍晚时分，李秀成步赴刑场，谈笑自若，并诵读了十句绝命词，以此表达自己对太平天国事业的忠诚。随后，他英勇就义，享年四十二岁。
李秀成死后，曾国藩下令将其尸体装入棺木安葬，同时遵照清廷旨意，将他的头颅装在小木笼里，派人沿途展示给江南地区的民众观看，以此作为警示。
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