同年十一月，李世民率军攻克长安，李渊拥立代王杨侑为帝，自任大丞相。次年（618 年），隋炀帝在江都被杀，李渊废杨侑称帝，建立唐朝，改元武德，李世民被封为秦王。此时的唐朝虽定都长安，但天下仍未统一 —— 窦建德在河北称帝，王世充在洛阳割据，刘武周在山西作乱，李世民奉命继续领兵出征，长孙氏则随他迁往秦王府居住。
秦王府的日子，远比太原时更为忙碌。李世民常年在外征战，最长一次曾连续八个月未归，府中大小事务全由长孙氏主持。她不仅要照料丈夫留下的子女（长子李承乾生于武德二年，长女长乐公主生于武德四年），还要接待往来的谋士将领。当时秦王府聚集了房玄龄、杜如晦、尉迟恭等一大批贤才，长孙氏深知这些人是丈夫成就大业的关键，便常常亲自为他们准备膳食，在他们遇到困难时伸出援手。房玄龄的母亲生病时，长孙氏派人送去药材与衣物，还亲自登门探望；尉迟恭因遭李建成排挤而心生不满，长孙氏便劝说李世民 “莫要寒了功臣之心”，让他多与尉迟恭沟通，最终稳住了这位猛将的心。
然而，随着李世民的战功日益显赫，他与太子李建成之间的矛盾也逐渐激化。李建成深知自己的军事才能远不及李世民，便联合李元吉，一方面在李渊面前诋毁李世民，说他 “意图谋反”；另一方面则在后宫中拉拢李渊的妃嫔（如尹德妃、张婕妤），让她们不断吹枕边风，离间李渊与李世民的关系。武德七年（624 年），李建成甚至暗中派人给李世民下毒，导致李世民吐血不止，险些丧命。
面对如此危急的局势，长孙氏展现出了超乎寻常的冷静与智慧。她深知后宫妃嫔的态度对李渊的决策影响重大，便主动加强与妃嫔们的往来：每逢节日，她都会送上精心准备的礼物；妃嫔们有子女出生，她也会亲自前往祝贺。一次，尹德妃的母亲生病，长孙氏带着人参、绸缎前去探望，还亲自为老人熬药，让尹德妃深受感动，此后便不再随意诋毁李世民。同时，长孙氏还多次劝说李世民 “隐忍待时”，不要与李建成正面冲突，以免给李渊留下 “兄弟不和” 的印象。她对李世民说：“如今殿下功高震主，若行事急躁，反而会授人以柄；不如先收敛锋芒，暗中积蓄力量，待时机成熟再作打算。”
武德九年（626 年），李建成与李元吉的阴谋愈发露骨 —— 他们计划在昆明池设宴杀害李世民，同时派大将杨文干在庆州起兵，里应外合夺取政权。得知消息后，秦王府的谋士将领们纷纷劝李世民先发制人，李世民却因 “兄弟之情” 而犹豫不决。此时，长孙氏亲自来到李世民的书房，对他说：“殿下若再迟疑，不仅自身难保，秦王府的将士与家眷也会性命不保；昔日周公诛管蔡，也是为了保全大周基业，殿下今日之举，并非不仁，而是大义。” 长孙氏的这番话，彻底坚定了李世民的决心。
武德九年六月初四（626 年 7 月 2 日），黎明时分的长安还笼罩在薄雾中，长孙氏却已起身，亲自为李世民整理铠甲。她的手指轻轻拂过铠甲上的纹路，眼中虽有担忧，却语气坚定地说：“殿下此去，务必小心；若事有成，妾与秦王府众人必当迎接殿下归来；若事不成，妾也愿与殿下共赴黄泉。” 李世民紧紧握住妻子的手，点头道：“你放心，我定会平安归来。”
随后，长孙氏来到秦王府的庭院中，面对早已集结待命的尉迟恭、秦叔宝、程知节等将领。她身着素色衣裙，却身姿挺拔，声音清亮地说：“今日之事，关乎秦王府的生死存亡，也关乎大唐的未来。诸位将军追随殿下多年，皆是忠义之士；妾在此承诺，若殿下与诸位将军得胜归来，妾必当亲自为诸位斟酒庆功；若诸位将军有所不测，妾也会照料好诸位的家眷，绝不让他们受半分委屈。” 将士们见长孙氏一介女子竟有如此胆识，无不深受鼓舞，齐声高呼：“愿为殿下效死！”
李世民率领将领们出发后，长孙氏立即关闭秦王府大门，组织府中的仆役与女眷拿起兵器，做好防御准备 —— 她深知李建成与李元吉若发现计划败露，很可能会派人袭击秦王府。同时，她还派心腹前往皇宫，密切关注局势变化，并随时向她汇报。
辰时许，玄武门方向传来阵阵厮杀声，长孙氏的心也随之提到了嗓子眼。她站在王府的阁楼之上，远眺皇宫方向，手中紧紧攥着一块玉佩（这是李世民送给她的定情信物）。大约半个时辰后，心腹匆匆回报：“殿下已在玄武门诛杀太子与齐王，如今正在前往武德殿面见陛下！” 长孙氏悬着的心终于放下，她立即下令打开王府大门，组织府中人准备迎接李世民归来。
然而，局势并未完全稳定。李建成与李元吉的部下得知主子被杀后，在薛万彻的带领下，聚集了两千余人猛攻玄武门，随后又转而攻打秦王府。面对汹涌而来的叛军，长孙氏毫不慌乱，她一方面让尉迟恭的妻子苏娬带领女眷守住内院，另一方面则亲自登上王府的墙头，对叛军喊道：“太子与齐王阴谋作乱，已被殿下诛杀；如今陛下已有旨意，立殿下为太子，诸位若能放下兵器，既往不咎；若执意反抗，便是与朝廷为敌，后果自负！” 叛军们本就因群龙无首而军心涣散，听到长孙氏的喊话后，纷纷放下兵器，薛万彻见大势已去，只得带领少数亲信逃往终南山。
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