咸丰三年二月二十日（公元1853年3月29日），南京城聚宝门（今中华门）外的校场上，数万太平军将士簇拥着一顶鎏金轿舆缓缓驶入。轿中端坐的洪秀全身着黄龙袍，头戴紫金冠，在一片“万岁”的山呼中，宣告这座有着六朝古都之称的城池正式成为太平天国的“天京”。
金田举义后，起义军一路出广西、入湖南、克武汉，于咸丰二年（1852年）十二月攻占武昌，兵力已从最初的万余人扩张至五十万（含随军家属）。咸丰三年正月初二（1853年2月9日），洪秀全下令放弃武昌，全军沿江东下，“舳舻千里，帆樯蔽江”，连克九江、安庆、芜湖，兵锋直指南京。
据《贼情汇纂》记载，太平军抵达南京城外时，“分兵占浦口，断北援；屯兵雨花台，扼南隘”，形成合围之势。正月二十九日（3月8日），起义军开始攻城，采用“穴地攻城”之法——在仪凤门（今兴中门）外挖掘地道，填埋炸药。二月初十（3月19日）午时，“轰然一声，城垣崩裂三丈余”，太平军先锋部队由缺口涌入，南京城破。两江总督陆建瀛于乱军中被杀，江宁将军祥厚率旗兵退守满城（今明故宫一带），至十二日（3月21日）城破自尽，满城男女老幼两万余人遭屠戮，史称“江宁之屠”。
占领南京后，太平天国领导层就是否定都展开争论。东王杨秀清主张“金陵乃帝王之家，城高池深，民富粮足，宜定为天京”（《李秀成自述》），洪秀全虽曾倾向继续北伐直捣北京，但最终采纳杨秀清建议。二月二十日，洪秀全自水西门入城，以两江总督署为基础改建天王府，正式宣布定都，改称“天京”，取“天国京师”之意。
定都天京后，太平天国随即展开政权建设，构建起一套既仿照明清制度、又融入宗教色彩的统治体系。
军政架构方面，以“天王”为最高领袖，下设“五军主将”（后改为“王爵”）分管军政。东王杨秀清居诸王之首，“节制诸王”，掌握实际军政大权，其东王府设吏、户、礼、兵、刑、工六部，成为天国行政中枢。据《金陵杂记》载，东王府“规制仅次于天王府，每日朝拜者络绎不绝，奏章必先呈东王，核批后再转天王”。
定都当月，杨秀清、萧朝贵联名发布《奉天讨胡檄布四方谕》，痛斥清廷“凡有水旱，略不怜恤，坐视其饿莩流离，暴露如莽”，宣布将推行《天朝田亩制度》。该制度提出“凡天下田，天下人同耕”的原则，规定“分田照人口，不论男妇，算其家口多寡，人多则分多，人寡则分寡”（《太平天国文书汇编》），试图建立“有田同耕，有饭同食，有衣同穿，有钱同使”的理想社会。虽因战乱未能全面推行，但在苏南、安徽等地，曾短暂实行“照旧交粮纳税”政策，部分减轻了农民负担。
城市管理上，天京实行军事化的“圣库制度”与“男馆女馆”制度。全城居民按性别、年龄编入不同馆营，男性入“男馆”从事劳作或参军，女性入“女馆”参与纺织、缝补，夫妻不得同居。物资由“圣库”统一调配，“凡私藏金银者，概行斩首”。这种绝对平均主义的管理模式，初期虽提升了生产效率和战斗能力，但长期压制人性需求，渐失民心。
文化政策则体现出强烈的反传统色彩。洪秀全视儒家经典为“妖书”，下令“凡一切孔孟诸子百家妖书邪说者，尽行焚除，皆不准买卖藏读也”（《诏书盖玺颁行论》），仅保留《圣经》（改称《新旧约》）及太平天国自编典籍。科举考试以“上帝教”教义为题，如“天父七日造成天地山海论”，录取者不论出身，甚至有女性参与科考，傅善祥成为中国历史上唯一的女状元。
为巩固天京政权，太平天国在定都后立即发起两大军事行动：北伐与西征。
咸丰三年四月（1853年5月），林凤祥、李开芳率两万精锐北伐，目标直捣北京。这支军队一路北上，经安徽、河南、山西，攻入直隶，前锋一度抵达天津杨柳青，震动清廷。咸丰帝急调僧格林沁率蒙古骑兵围剿，北伐军因孤军深入、补给断绝，于咸丰五年（1855年）全军覆没。《清史稿·文宗本纪》载：“（咸丰五年）正月，僧格林沁破贼于连镇，擒林凤祥，磔之（分裂肢体的酷刑）。四月，破冯官屯，擒李开芳，诛之，北伐贼平。”北伐虽败，却牵制了清军主力，为西征创造了条件。
西征军由胡以晃、赖汉英统领，于咸丰三年五月（1853年6月）溯江而上，旨在夺取安庆、九江、武汉等战略要地，控制长江中游。至咸丰四年（1854年），西征军先后攻克安庆、九江，并重占武汉，势力扩展至湖南。但在湘潭遭遇曾国藩湘军的顽强抵抗，被迫退守九江。此后，石达开率军增援，于湖口大败湘军水师，“烧其战船百余艘，曾国藩仅以身免”（《湘军志》），西征局势得以扭转。至咸丰六年（1856年），太平天国已控制从武昌到镇江的长江沿线，形成“天京—安庆—九江—武汉”的战略防线。
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